1. 了解偶氮苯的光學(xué)異構(gòu)反應(yīng)，加深對(duì)光化學(xué)反應(yīng)的理解。 2. 掌握薄層層析的基本操作,薄層層析分離順、反式偶氮苯。
3. 了解柱層析分離有機(jī)化合物的原理，初步掌握層析柱裝填和洗脫的操作方法 4. 采用柱層析分離反式偶氮苯與靛紅的混合物
偶氮苯是**簡(jiǎn)單的芳香偶氮化合物，眾多偶氮染料的母體結(jié)構(gòu)。含有兩個(gè)苯基分別與偶氮基–N=N–兩端相連的結(jié)構(gòu)。偶氮苯有毒，易燃。偶氮苯有順（Z）-反（E）-異構(gòu)體。反式為橙紅色棱形晶體，蒸氣為深紅色，溶于乙醇、乙醚、醋酸和水。反式的熱力學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。當(dāng)溶于乙醇的偶氮苯用一定強(qiáng)度的紫外光照射時(shí)，順式的比例逐漸增大，直**達(dá)到平衡，形成順?lè)串悩?gòu)體的混合物。偶氮苯的光致異構(gòu)是很多偶氮類(lèi)功能材料光響應(yīng)的基礎(chǔ)。順式為橙紅色片狀晶體，不穩(wěn)定，在加熱或可見(jiàn)光照射下能夠變成反式。
色譜方法是通過(guò)在固定相和流動(dòng)相間分配的不同而將物質(zhì)分離開(kāi)。待分離混合物各組分在固定相上的吸附強(qiáng)度不同，與流動(dòng)相一起移動(dòng)的速度也不同，因此被分離開(kāi)。
儀器與試劑
分析天平，TLC，錐形瓶，毛細(xì)管，層析柱，棉花，量筒，硅膠，蒸發(fā)皿，展缸；EtOAc, CH2Cl2, 石油醚，靛紅；請(qǐng)自帶尺子（用于計(jì)算Rf值）
顏老師在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始之前已經(jīng)準(zhǔn)備好的試劑：a. 偶氮苯的溶液（15 mg in 1mL EtOH）；b.靛紅的溶液（15 mg in 1mL CH2Cl2）；c. 靛紅與偶氮苯的均勻混合物（靛紅1.4 g + 偶氮苯3.5 g）。
實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
a) 光照異構(gòu)化
取0.1 g反式偶氮苯溶于5 mL無(wú)水乙醇中，將此溶液放于試管中，密封，置于可見(jiàn)光下二星期，以便與光照前的溶液進(jìn)行對(duì)比。
b) 薄層層析
取管口平整的毛細(xì)管吸取光照后的偶氮苯溶液，在離薄層板邊沿約0.5 cm的起點(diǎn)線上點(diǎn)樣。再用另一毛細(xì)管吸取未經(jīng)光照的反式偶氮苯溶液點(diǎn)樣。待乙醇揮發(fā)后，將點(diǎn)好樣品的薄層板放入內(nèi)襯濾紙的展缸中。展缸內(nèi)已放置展開(kāi)劑（乙酸乙酯/石油醚=1/40）。薄層板的點(diǎn)樣端在下方，浸入展開(kāi)劑，展開(kāi)劑不要沒(méi)過(guò)起點(diǎn)線，也不要碰到樣品點(diǎn)。待展開(kāi)劑前沿上升到離板的上端約1 cm處時(shí)，取出薄層板，立即用鉛筆在展開(kāi)劑上升的前沿處劃一記號(hào)，置于空氣中晾干?？捎^察到薄層板上經(jīng)光照后的偶氮苯溶液點(diǎn)樣處上端有兩個(gè)黃色斑點(diǎn)（哪一個(gè)斑點(diǎn)是順式的？哪一個(gè)斑點(diǎn)是反式的？）。計(jì)算異構(gòu)體的fR值。
用上述相同的方法，采用Ethyl Acetate : Petroleum Ether = 1:1為展開(kāi)劑，對(duì)靛紅與偶氮苯的混合物進(jìn)行TLC，為下面的柱層析選擇展開(kāi)劑。
c) 柱層析
1．將層析柱固定在鐵架臺(tái)上，一定要保持柱子豎直。 2．將層析柱洗凈后在柱底部放入一小團(tuán)脫脂棉花。
3．在錐形瓶中稱重7g 硅膠（SiO2），并用Ethyl Acetate : Petroleum Ether
(1:40)調(diào)勻。在層析柱的下方放置一個(gè)錐形瓶，以收集流下的液體。加入少量洗脫劑于層析柱中，以潤(rùn)濕棉花，使其貼在柱子下端。
4．打開(kāi)層析柱活塞，控制溶劑下流，將硅膠懸濁液沿柱子側(cè)壁加入，并用
少量的溶劑洗去殘余的硅膠，并加入柱中。用裝有橡皮管或塞子由下向上輕輕敲擊柱子外壁，將氣泡趕出，使硅膠填裝均勻。并加壓使硅膠緊密，以獲得較好的分離效果。輕輕敲擊，使硅膠**上層成均勻平面，然后用藥匙沿柱子側(cè)壁，輕輕地、慢慢地在硅膠表面覆蓋一層海砂（注意：不要破壞硅膠的上平面）。關(guān)閉活塞，備用。
5．打開(kāi)活塞，當(dāng)溶劑液面降**海砂表面時(shí)，關(guān)閉活塞。用滴管沿柱子側(cè)壁
加入靛紅與偶氮苯混合物的溶液（稱取40 mg，置于1.5mL的塑料樣品管，加入1 mL二氯甲烷（CH2Cl2），超聲振蕩使其溶解）。打開(kāi)活塞，使溶劑液面降**海砂表面，關(guān)閉活塞。再用少量的展開(kāi)劑洗塑料樣品管，加入層析譜中，并注意洗去粘附在柱壁上的液滴，打開(kāi)活塞，流到液面，關(guān)閉活塞。重復(fù)上述操作，直到將所有化合物沖到硅膠里面。 6．沿側(cè)壁加入大量的洗脫劑Ethyl Acetate : Petroleum Ether (1:40)，打開(kāi)活
塞，加壓保持一定的流速，觀察色帶的形成和分離。
7．當(dāng)**個(gè)有色帶到達(dá)柱底時(shí)，并且沒(méi)有流出之前，關(guān)閉活塞，倒空錐形
瓶，打開(kāi)活塞，收集全部色帶。然后，改用Ethyl Acetate : Petroleum Ether (1:1)作為洗脫劑。關(guān)閉活塞，換一個(gè)空的且干凈的錐形瓶，打開(kāi)活塞。當(dāng)?shù)诙€(gè)有色帶到達(dá)柱底時(shí)，并且沒(méi)有流出之前，關(guān)閉活塞，倒空錐形瓶，打開(kāi)活塞，收集全部色帶。柱層析分離結(jié)束。
8．柱層析分離結(jié)束后，采用TLC對(duì)上述分離的兩個(gè)溶液進(jìn)行分析，總結(jié)分
離效果。同時(shí)，打開(kāi)層析柱活塞，在加壓下讓展開(kāi)劑流干，然后將硅膠倒入指定的固體廢物桶中。切勿倒入水槽或普通垃圾桶。
預(yù)習(xí)時(shí)的問(wèn)題
1.在薄層層析實(shí)驗(yàn)中，為什么點(diǎn)樣的樣品斑點(diǎn)不可浸入展開(kāi)劑的溶液中？為什么進(jìn)行薄層層析時(shí)展缸要蓋上蓋？ #p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
2.當(dāng)用混合物進(jìn)行薄層層析時(shí)，如何判斷各組分的在薄層板上的位置？靛紅與偶氮苯，哪一個(gè)的極性較強(qiáng)？為什么？
3.柱層析時(shí)柱中若留有空氣或者是填裝不均勻，對(duì)分離效果有何影響？如何避免？
4.偶氮苯和靛紅物理化學(xué)性質(zhì)？毒性？有什么應(yīng)用？偶氮苯光照異構(gòu)化的機(jī)理？why is trans-azobenzene more stable than cis-azobenzene?
其它閱讀材料
1.光化學(xué)
由光的作用引起的化學(xué)反應(yīng)近年來(lái)日益受到人們的重視，光合作用就是**重要的光化學(xué)反應(yīng)。研究激發(fā)態(tài)分子化學(xué)行為的光化學(xué)反應(yīng)已經(jīng)成為有機(jī)化學(xué)的一個(gè)重要分支。光不僅可以引起多種多樣的化學(xué)反應(yīng)，合成各種**的奇妙反應(yīng)分子，而且與我們的日常生活及生命現(xiàn)象有著密切的聯(lián)系。 2. 薄層色譜 1. 固定相的選擇
氧化鋁和硅膠是薄層層析色譜常用的固定相。氧化鋁多用于分離堿性或中性有機(jī)物；而硅膠的吸附性源于表面的Si-OH基，主要用于分離酸性、中性有機(jī)物質(zhì)。
薄層色譜用的硅膠有薄層色譜用的硅膠有60G、6OGF254、60H、60HF254和60HF254+366等類(lèi)型，其中G表示含有13％硫酸鈣（作為黏合劑）；H表示不含硫酸鈣；F254表示含有2％無(wú)機(jī)熒光物質(zhì)，在254 nm的紫外光照射下發(fā)出綠色熒光。與硅膠相似，氧化鋁也因含有黏合劑或熒光劑而分為氧化鋁H、氧化鋁G、氧化鋁HF254和氧化鋁GF254等類(lèi)型。黏合劑除硫酸鈣外，還可用淀粉、羧甲基纖維素（CMC)。 2. 操作方法 ①點(diǎn)樣
在薄層板一端約1cm處，用鉛筆輕輕劃一條作為起點(diǎn)線。樣品用易揮發(fā)性溶劑溶解后，用毛細(xì)管吸取樣品溶液，輕輕接觸到起點(diǎn)線的某一位置上。如果溶液太稀，可多點(diǎn)幾次，但要等**次樣品溶劑揮發(fā)后，再點(diǎn)第二次。
點(diǎn)好樣品后，待溶劑揮發(fā)干凈，才可以進(jìn)行下面的展開(kāi)過(guò)程。
大學(xué)化學(xué)實(shí)驗(yàn)
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氧化鋁HF254和氧化鋁GF254等類(lèi)型。黏合劑除硫酸鈣外，還可用淀粉、羧甲基纖維素（CMC)。 2. 操作方法 ①點(diǎn)樣
在薄層板一端約1cm處，用鉛筆輕輕劃一條作為起點(diǎn)線。樣品用易揮發(fā)性溶劑溶解后，用毛細(xì)管吸取樣品溶液，輕輕接觸到起點(diǎn)線的某一位置上。如果溶液太稀，可多點(diǎn)幾次，但要等**次樣品溶劑揮發(fā)后，再點(diǎn)第二次。
點(diǎn)好樣品后，待溶劑揮發(fā)干凈，才可以進(jìn)行下面的展開(kāi)過(guò)程。
②展開(kāi)劑的選擇
選擇展開(kāi)劑，shou先應(yīng)考慮對(duì)被分離物有一定的溶解度和解吸能力。由于硅膠和氧化鋁都是極性吸附劑，所以展開(kāi)劑的極性越大，試樣在薄板上移動(dòng)的距離越遠(yuǎn)，fR值（fR值是一個(gè)化合物在薄層板上上升的高度與展開(kāi)劑上升的高度的比值）越大。例如，在分離過(guò)程中常發(fā)現(xiàn)fR太小，說(shuō)明展開(kāi)劑極性不夠，需要考慮加入一種極性強(qiáng)的展開(kāi)劑進(jìn)行調(diào)控。發(fā)現(xiàn)fR值太小，說(shuō)明展開(kāi)劑極性不夠，需要考慮加入一種極性強(qiáng)的展開(kāi)劑進(jìn)行調(diào)控。
常用展開(kāi)劑的洗脫力由小到大的順序?yàn)椋菏兔?、環(huán)己烷、四氯化碳、二氯甲烷、氯仿、乙醚、四氫呋喃、乙酸乙醋、丙酮、正丁醇、乙醇、甲醇、水、冰乙酸、吡啶、有機(jī)酸等。
此外，在展開(kāi)過(guò)程中，展開(kāi)缸內(nèi)展開(kāi)劑的蒸氣須始終處于飽和狀態(tài)。一般可用一塊方型濾紙貼于缸壁上（下端浸于展開(kāi)劑中），蓋好密封一段時(shí)間。取放薄層板應(yīng)迅速。
③顯色
展開(kāi)后，要等溶劑揮發(fā)完才能顯色。若被分離的是有色組分，展開(kāi)板上即呈現(xiàn)出有色斑點(diǎn)。若化合物本身無(wú)色，則可以在紫外燈觀察有無(wú)熒光斑點(diǎn)；或用碘蒸氣熏的方法顯色。顯色后，用鉛筆輕輕畫(huà)出斑點(diǎn)位置，計(jì)算fR值。 3．柱色譜
吸附層析柱的分離效果不僅依賴于吸附劑和洗脫溶劑的選擇，而且與制成的層析柱有關(guān)；要求柱中的吸附劑用量為被分離樣品量的30-40倍，若需要可增**100倍。
柱高與直徑之比為4:1**10:1，一般為7.5:1。實(shí)驗(yàn)室常用的層析柱,其直徑在0.5-10 cm之間。當(dāng)吸附物的色帶占吸附劑高度的1/10—1/4時(shí)，此層析柱已經(jīng)可作層析分離了。
柱層析常用吸附劑有氧化鋁、硅膠、氧化鎂、碳酸鈣及活性炭等，吸附劑要求顆粒大小均勻，越細(xì)分離效果越佳，但此時(shí)洗脫阻力會(huì)增大，所以要選擇合適大小的吸附劑。氧化鋁分酸性、中性和堿性三種，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用中性氧化鋁。
化合物的吸附能力與它的極性成正比，具有較大極性基團(tuán)的化合物，其在吸附劑上吸附能力較強(qiáng)。氧化鋁對(duì)各化合物的吸附性按以下次序遞減：酸>醇，胺，硫醇>酯，醛，酮>烴>鹵化物，醚>烯>飽和烴。強(qiáng)吸附性的化合物要用強(qiáng)極性溶劑來(lái)洗脫。
作為洗脫劑的溶劑要求其具有一定極性，適合于被分離物的分離，體積盡量要小，此外要求易揮發(fā)，易除去(乙醚等揮發(fā)性太大的溶劑不合適)。洗脫劑的極性按下列次序遞增：己烷或石油醚<環(huán)己烷<四氯化碳<三氯乙烯<二硫化碳<甲苯<苯<二氯甲烷<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<丙醇<乙醇<甲醇<水<吡啶<乙酸。 #p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
裝柱要求吸附劑必須均勻填充于柱內(nèi)，不能有氣泡和裂縫，否則將影響洗脫和分離。在裝柱時(shí)，通常把柱子豎直固定好，關(guān)閉下端活塞，底部用少量脫脂棉輕輕塞緊，加入0.5 cm厚的海砂，然后加入溶劑到柱子體積的1/4，用一定量的溶劑與吸附劑在燒杯中調(diào)成糊狀，打開(kāi)柱下端的活塞，讓溶劑一滴一滴地滴入錐形瓶中，同時(shí)把糊狀物快速倒入柱中，吸附劑通過(guò)溶劑慢慢下沉，進(jìn)行均勻填充。柱頂部1/4處一般不填充吸附劑：以便使吸附劑上面始終保持一液層。柱填充好后，上面再覆蓋0.5 cm厚的海砂。
過(guò)柱時(shí)，shou先把試樣溶解在**小體積的溶劑中，用滴管將試液加到吸附劑的上面；試液加完并流到吸附劑上端時(shí)，立即加入展開(kāi)劑進(jìn)行展開(kāi)，自始**終保持柱內(nèi)液面高于吸附劑的頂端，否則柱內(nèi)將出現(xiàn)氣泡或裂縫。
試樣中極性小的組分shou先被洗脫下來(lái)，極性大的組分吸附較強(qiáng)，后被洗脫下來(lái)。
